His-Tag 蛋白純化磁珠
簡(jiǎn)介:磁珠純化組氨酸標(biāo)簽蛋白,無(wú)需對(duì)樣品進(jìn)行多次長(zhǎng)時(shí)間的高速離心和濾膜過(guò)濾、無(wú)需控制流速、更無(wú)需高昂的層析設(shè)備。樣品與磁珠的特異性結(jié)合、洗滌以及目標(biāo)蛋白的洗脫變得簡(jiǎn)單、快速、易操作。對(duì)于熟練的操作者而言,在 1h 內(nèi)就能獲得高純度的目標(biāo)蛋白,且能輕松實(shí)現(xiàn)高通量和大規(guī)模樣品的平行處理,為研究者節(jié)省了時(shí)間和成本。
產(chǎn)品名稱(chēng):Beads-IDA-Ni
螯合金屬離子:Ni2+
磁珠含量:100 mg/mL
蛋白結(jié)合量:30-40 μg/mg
保存液:20%乙醇(v/v)
適用范圍:適用于純化細(xì)菌、酵母、昆蟲(chóng)和哺乳動(dòng)物細(xì)胞等分泌或胞內(nèi)表達(dá)的可溶性組氨酸標(biāo)簽蛋白,也可用于變性蛋白的純化(包涵體需變性后再進(jìn)行純化)。
操作步驟:
1、緩沖液的準(zhǔn)備
目標(biāo)蛋白與組氨酸標(biāo)簽蛋白純化磁珠的結(jié)合性能將直接影響目標(biāo)蛋白的純化效率,而各種緩沖液配制也將在一定程度上影響目標(biāo)蛋白的回收率和純度。因此,在較大規(guī)模蛋白純化之前,用戶(hù)應(yīng)該自行設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn),篩選出適合純化目標(biāo)蛋白的緩沖液體系,主要包括 Binding Buffer、Washing Buffer、Elution Buffer。
增加咪唑濃度進(jìn)行洗脫是組氨酸標(biāo)簽純化磁珠最常用的洗脫方法,首次使用時(shí),在不確定最佳的洗脫咪唑濃度情況下,推薦在緩沖液中分別加入 10mM、20mM、50mM、100mM、200mM、300mM、400mM、500mM咪唑,濃度從低到高分別洗脫,磁吸后收集蛋白上清液,之后通過(guò) SDS-PAGE電泳等方法鑒定洗脫結(jié)果。
以下提供的緩沖液體系適用于多數(shù)組氨酸標(biāo)簽蛋白的純化,供用戶(hù)參考。Binding Buffer:20mM磷酸緩沖液,0~50mM 咪唑,pH7.4;WashingBuffer:20mM磷酸緩沖液,50~100mM 咪唑,pH7.4;Elution Buffer:20mM磷酸緩沖液, 100-500mM 咪唑,pH7.4;
2、磁珠預(yù)處理
預(yù)估蛋白表達(dá)量,根據(jù)30-40ug/mg蛋白的結(jié)合量投入合適量的磁珠,假如預(yù)估表達(dá)量為10-20mg,那么需要投入500mg的磁珠;利用磁鐵或者磁力架去除磁珠保存液,加入保存液相同體積的Bingding Buffer清洗3次,每次上下翻轉(zhuǎn) 10-20次,去除上清液;建議磁性分離時(shí)間為30-60s。
3、目標(biāo)蛋白與磁珠的結(jié)合
加入目標(biāo)蛋白樣品(建議目標(biāo)粗蛋白溶液與Binding Buffer相同,如果不同,建議使用超濾或者透析的方式進(jìn)行 Buffer替換).震蕩混勻 30s,室溫或者冷藏旋轉(zhuǎn)混勻10-30分鐘(如果目標(biāo)蛋白溫度穩(wěn)定性差,可在冷藏條件下進(jìn)行,適當(dāng)增加結(jié)合時(shí)間至1-2個(gè)小時(shí))。
4、磁珠洗滌
加入合適體積的Washing Buffer(建議體積為1-2mL/100mg),顛倒混勻數(shù)次,磁性分離,去除上清,重復(fù)操作3-5 次直至沒(méi)有雜蛋白出現(xiàn)(建議使用分光光度計(jì)OD280進(jìn)行質(zhì)量控制);
5、目標(biāo)蛋白洗脫
用戶(hù)可根據(jù)需要改變洗脫體積調(diào)整目標(biāo)蛋白濃度,加入合適體積的 Elution Buffer,輕輕翻轉(zhuǎn)離心管數(shù)次,使磁珠懸浮,磁性分離,收集洗脫液到新的離心管中,即為純化的目標(biāo)蛋白樣品;如果需要,可以重復(fù)上述步驟 1 次,收集樣品到新的離心管中,以檢測(cè)目標(biāo)蛋白是否洗脫完全。
6、磁珠后處理
(1)在裝有磁珠的離心管中加入 2mL/100mg的500 mM 咪唑,上下翻轉(zhuǎn)離心管數(shù)次,使磁珠懸浮,磁性分離,去除上清液。
(2)重復(fù)上述步驟 2 次。
(3)在離心管中加入2mL/100mg的ddH2O,上下翻轉(zhuǎn)離心管數(shù)次,使磁珠懸浮,磁性分離,去除上清液。
(4)重復(fù)上述步驟2次。
(5)加入 Storage Buffer 到磁珠中使總體積為 1mL/100mg,保存于 2~30℃(長(zhǎng)期保存,置于2~8℃),可用于下一次同種蛋白的純化。
7、磁珠再生
磁珠連續(xù)使用三次以上,其結(jié)合目標(biāo)蛋白的能力可能會(huì)明顯降低,建議進(jìn)行磁珠再生處理。
Stripping Buffer:20mM 磷酸緩沖液,500 mM NaCI,100 mM EDTA,pH7.4
Beads Washing Buffer(可選):0.5 M NaOH,2M NaCI
Recharge Buffer:100mM NiSO4(該化學(xué)試劑有一定的毒性,可能造成過(guò)敏反應(yīng),使用時(shí)務(wù)必注意)
Storage Buffer:20%(v/)乙醇
以5mL (500mg)磁珠懸液為例,詳細(xì)說(shuō)明磁珠再生操作:
(1)將磁珠懸液進(jìn)行磁性分離,去除上清液,從磁性分離器上取下離心管,在離心管中加入5mL ddH2O,上下翻轉(zhuǎn)離心管數(shù)次,使磁珠重新懸浮,磁性分離,去除上清液。
(2)加入5mL Stripping Buffer,上下翻轉(zhuǎn)離心管數(shù)次,使磁珠重新懸浮,室溫旋轉(zhuǎn)混合 5min,磁性分離,去除上清液。重復(fù)此步驟 1 次。
(3)加入5mL ddH2O,上下翻轉(zhuǎn)離心管數(shù)次,使磁珠重新懸浮,磁性分離,去除上清液,重復(fù)此步驟 2 次。
(4)堿處理:加入5mL Beads Washing Buffer,上下翻轉(zhuǎn)離心管數(shù)次,使磁珠重新懸浮,室溫旋轉(zhuǎn)混合 5min,磁性分離,去除上清液。加入 5mLddH2O,上下翻轉(zhuǎn)離心管數(shù)次,使磁珠重新懸浮,磁性分離,去除上清液。重復(fù)ddH2O 洗滌步驟 3~5 次,至洗滌液呈中性為止。
(5)加入 5mL Recharge Buffer,上下翻轉(zhuǎn)離心管數(shù)次,使磁珠重新懸浮,室溫旋轉(zhuǎn)混合 20min,磁性分離,去除上清液。
(6)加入5mL ddH2O,上下翻轉(zhuǎn)離心管數(shù)次,使磁珠重新懸浮,磁性分離,去除上清液。重復(fù)此步驟 6次以上,保證鎳離子去除完全。
(7)加入 Storage Buffer 到磁珠中使總體積為5mL,保存于2~30℃(長(zhǎng)期保存,置于2~8℃)。