His-Tag 蛋白純化磁珠

簡(jiǎn)介：磁珠純化組氨酸標(biāo)簽蛋白，無需對(duì)樣品進(jìn)行多次長(zhǎng)時(shí)間的高速離心和濾膜過濾、無需控制流速、更無需高昂的層析設(shè)備。樣品與磁珠的特異性結(jié)合、洗滌以及目標(biāo)蛋白的洗脫變得簡(jiǎn)單、快速、易操作。對(duì)于熟練的操作者而言，在 1h 內(nèi)就能獲得高純度的目標(biāo)蛋白，且能輕松實(shí)現(xiàn)高通量和大規(guī)模樣品的平行處理，為研究者節(jié)省了時(shí)間和成本。

產(chǎn)品名稱：Beads-IDA-Ni

螯合金屬離子：Ni²⁺

磁珠含量：100 mg/mL

蛋白結(jié)合量：30-40 μg/mg

保存液：20%乙醇（v/v）

適用范圍：適用于純化細(xì)菌、酵母、昆蟲和哺乳動(dòng)物細(xì)胞等分泌或胞內(nèi)表達(dá)的可溶性組氨酸標(biāo)簽蛋白，也可用于變性蛋白的純化（包涵體需變性后再進(jìn)行純化）。

操作步驟:

1、緩沖液的準(zhǔn)備

目標(biāo)蛋白與組氨酸標(biāo)簽蛋白純化磁珠的結(jié)合性能將直接影響目標(biāo)蛋白的純化效率，而各種緩沖液配制也將在一定程度上影響目標(biāo)蛋白的回收率和純度。因此，在較大規(guī)模蛋白純化之前，用戶應(yīng)該自行設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，篩選出適合純化目標(biāo)蛋白的緩沖液體系，主要包括 Binding Buffer、Washing Buffer、Elution Buffer。

增加咪唑濃度進(jìn)行洗脫是組氨酸標(biāo)簽純化磁珠最常用的洗脫方法，首次使用時(shí)，在不確定最佳的洗脫咪唑濃度情況下，推薦在緩沖液中分別加入 10mM、20mM、50mM、100mM、200mM、300mM、400mM、500mM咪唑，濃度從低到高分別洗脫，磁吸后收集蛋白上清液，之后通過 SDS-PAGE電泳等方法鑒定洗脫結(jié)果。

以下提供的緩沖液體系適用于多數(shù)組氨酸標(biāo)簽蛋白的純化，供用戶參考。Binding Buffer:20mM磷酸緩沖液，0~50mM 咪唑，pH7.4;WashingBuffer:20mM磷酸緩沖液，50~100mM 咪唑，pH7.4;Elution Buffer:20mM磷酸緩沖液， 100-500mM 咪唑，pH7.4;

2、磁珠預(yù)處理

預(yù)估蛋白表達(dá)量，根據(jù)30-40ug/mg蛋白的結(jié)合量投入合適量的磁珠，假如預(yù)估表達(dá)量為10-20mg，那么需要投入500mg的磁珠;利用磁鐵或者磁力架去除磁珠保存液，加入保存液相同體積的Bingding Buffer清洗3次，每次上下翻轉(zhuǎn) 10-20次，去除上清液;建議磁性分離時(shí)間為30-60s。

3、目標(biāo)蛋白與磁珠的結(jié)合

加入目標(biāo)蛋白樣品(建議目標(biāo)粗蛋白溶液與Binding Buffer相同，如果不同，建議使用超濾或者透析的方式進(jìn)行 Buffer替換).震蕩混勻 30s，室溫或者冷藏旋轉(zhuǎn)混勻10-30分鐘(如果目標(biāo)蛋白溫度穩(wěn)定性差，可在冷藏條件下進(jìn)行，適當(dāng)增加結(jié)合時(shí)間至1-2個(gè)小時(shí))。

4、磁珠洗滌

加入合適體積的Washing Buffer(建議體積為1-2mL/100mg)，顛倒混勻數(shù)次，磁性分離，去除上清，重復(fù)操作3-5 次直至沒有雜蛋白出現(xiàn)(建議使用分光光度計(jì)OD280進(jìn)行質(zhì)量控制);

5、目標(biāo)蛋白洗脫

用戶可根據(jù)需要改變洗脫體積調(diào)整目標(biāo)蛋白濃度，加入合適體積的 Elution Buffer，輕輕翻轉(zhuǎn)離心管數(shù)次，使磁珠懸浮，磁性分離，收集洗脫液到新的離心管中，即為純化的目標(biāo)蛋白樣品;如果需要，可以重復(fù)上述步驟 1 次，收集樣品到新的離心管中，以檢測(cè)目標(biāo)蛋白是否洗脫完全。

6、磁珠后處理

(1)在裝有磁珠的離心管中加入 2mL/100mg的500 mM 咪唑，上下翻轉(zhuǎn)離心管數(shù)次，使磁珠懸浮，磁性分離，去除上清液。

(2)重復(fù)上述步驟 2 次。

(3)在離心管中加入2mL/100mg的ddH₂O，上下翻轉(zhuǎn)離心管數(shù)次，使磁珠懸浮，磁性分離，去除上清液。

(4)重復(fù)上述步驟2次。

(5)加入 Storage Buffer 到磁珠中使總體積為 1mL/100mg，保存于 2~30℃(長(zhǎng)期保存，置于2~8℃)，可用于下一次同種蛋白的純化。

7、磁珠再生

磁珠連續(xù)使用三次以上，其結(jié)合目標(biāo)蛋白的能力可能會(huì)明顯降低，建議進(jìn)行磁珠再生處理。

Stripping Buffer:20mM 磷酸緩沖液，500 mM NaCI，100 mM EDTA，pH7.4

Beads Washing Buffer(可選):0.5 M NaOH，2M NaCI

Recharge Buffer:100mM NiSO₄(該化學(xué)試劑有一定的毒性，可能造成過敏反應(yīng)，使用時(shí)務(wù)必注意)

Storage Buffer:20%(v/)乙醇

以5mL (500mg)磁珠懸液為例，詳細(xì)說明磁珠再生操作:

(1)將磁珠懸液進(jìn)行磁性分離，去除上清液，從磁性分離器上取下離心管，在離心管中加入5mL ddH₂O，上下翻轉(zhuǎn)離心管數(shù)次，使磁珠重新懸浮，磁性分離，去除上清液。

(2)加入5mL Stripping Buffer，上下翻轉(zhuǎn)離心管數(shù)次，使磁珠重新懸浮，室溫旋轉(zhuǎn)混合 5min，磁性分離，去除上清液。重復(fù)此步驟 1 次。

(3)加入5mL ddH₂O，上下翻轉(zhuǎn)離心管數(shù)次，使磁珠重新懸浮，磁性分離，去除上清液，重復(fù)此步驟 2 次。

(4)堿處理：加入5mL Beads Washing Buffer，上下翻轉(zhuǎn)離心管數(shù)次，使磁珠重新懸浮，室溫旋轉(zhuǎn)混合 5min,磁性分離，去除上清液。加入 5mLddH₂O，上下翻轉(zhuǎn)離心管數(shù)次，使磁珠重新懸浮，磁性分離，去除上清液。重復(fù)ddH₂O 洗滌步驟 3~5 次，至洗滌液呈中性為止。

(5)加入 5mL Recharge Buffer，上下翻轉(zhuǎn)離心管數(shù)次，使磁珠重新懸浮，室溫旋轉(zhuǎn)混合 20min，磁性分離，去除上清液。

(6)加入5mL ddH₂O，上下翻轉(zhuǎn)離心管數(shù)次，使磁珠重新懸浮，磁性分離，去除上清液。重復(fù)此步驟 6次以上，保證鎳離子去除完全。

(7)加入 Storage Buffer 到磁珠中使總體積為5mL，保存于2~30℃(長(zhǎng)期保存，置于2~8℃)。